摘要：地*是我国常见的大宗药材之一，药用历史悠久。近年来，随着分子生物学技术的进步，尤其是高通量测序技术的出现，不仅为地*的快速鉴定提供了新方法，也较全面地揭示了其种群的遗传多样性和亲缘关系，更为地*的活性成分合成代谢调控、块根发育、抗逆响应和连作障碍等机制的研究奠定了分子基础。从系统学研究、分子鉴定、功能基因等方面对近年来地*分子生物学的研究进展进行了综述，并提出3点研究展望，以期为进一步深入开展地*的分子研究提供参考。
地*属RehmanniaLibosch.exFisch.etMey.隶属于列当科（Orobanchaceae），为中国特有属。据《中国植物志》记载该属有6个原生种，分布较为广泛，不同的生境导致该属植物外观形态差异较大，经常造成分类学上的争议，如化学成分及分子证据显示高地*R.elataN.E.Brown和裂叶地*R.piasezkiiMaxim.实为同种植物，茄叶地*R.solanifoliaTsoongetChin与地*R.glutinosa(Gaetn.)Libosch.exFisch.etMey.也应予以归并[1-2]。地*属中湖北地*R.henryiN.E.Brown会被当地药农用作中药地*的替代品。地*是药用地*的唯一基原植物，其块根具有广泛的药理活性，如滋阴健肾、清热解*、补血、防癌、抗癌、增强免疫力、延缓衰老、增强造血能力和降低血糖等[3-4]，具有很高的药用价值。其药用成分主要是环烯醚萜类化合物，目前已从地*中分离鉴定出70余种，包括梓醇（catalpol）、益母草苷、桃叶珊瑚苷、二氢梓醇、地*苷A、地*苷D等，其中梓醇是地*的标志性成分，在《中国药典》年版中被列为地*的质量评价指标，其对神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病有显著疗效。研究表明，产地、品种等差异对地*品质影响较大，在地*主产区，以河南的怀地*最为著名，质量最优[5]，但地*品种众多，优劣混杂，品种间形态相近，采用传统的形态特征和系谱来源进行鉴定较为困难。此外，地*作为是我国最为常见的大宗药材之一，提高其药用成分的积累和克服连作障碍等是提高其经济价值亟需面对的重要课题。鉴于上述因素，近年来研究者在地*的系统学研究、分子鉴定及功能基因等方面开展了大量研究，并取得了长足进展，不仅为地*的快速鉴定提供了新方法，也较全面地揭示了其种群的遗传多样性和亲缘关系，更为地*的活性成分合成代谢调控、块根发育、抗逆响应和连作障碍等机制的研究奠定了分子基础。为此，本文尝试对此进行综述，以期为进一步深入开展地*的分子研究提供参考。
1地*分子系统学研究
1.1地*属分类地位修订
由于潜在的杂交和多倍化现象，地*属的系统位置存在争议。经典分类学将地*属归于玄参科（Scrophulariaceae），但基于地*属和崖白菜属植物的叶绿体部分片段（rbcL、ndhF、rps16、trnL-F）和核基因组ITS序列的比较分析，研究者认为应将地*属划分为列当科的第2个非寄生分支[6]，目前该建议得到被子植物分类系统（APG）的认可和采纳，在APGIV中已将地*属归在了列当科。这一更改的正确性也在随后的研究中得到佐证，如6种地*属植物的叶绿体基因组全序列、蛋白编码序列、LSC和SSC4个数据集对唇形目23个物种的系统发育重建显示地*属是一个单系类群，且与列当科的其他物种构成姐妺类群[7-8]。从而，地*属的系统分类地位在基因组水平上得到修订。
1.2地*属内种间关系分析
除系统分类外，地*属的属内种间关系也得到明确。基于形态学、花粉、同工酶、化学组成和叶绿体基因trnL-F、rps16和核基因ITS基因等分析，认为裂叶地*与高地*应归为同一物种[9-14]，天目地*R.chingiiLi与湖北地*、地*和茄叶地*分别组成姐妹类群[15]。其中地*和茄叶地*的染色体倍数相同、叶绿体和核基因同为单倍型，被认为是同源植物，在该属中进化水平最高[10-11]。然而不同的分子标记得到的物种关系及分化次序并不一致，甚至互相矛盾，核基因组数据显示裂叶地*在本属中最早分化[11]，而叶绿体数据则显示天目地*才是最原始分支[6]。为此，刘占林等[16]基于叶绿体与核基因片段，同时采用最大简约法（MP）、最大似然法（ML）和贝叶斯法对地*属进行系统发育重建，结果支持天目地*是原始类群的观点，并认为地*属物种的形成与中新世末期的地理气候条件关系密切，在经历了3次扩张与2次隔离事件后形成地*属植物的差异性分布态势。
1.3地*种内遗传多样性探讨
地*品种的遗传多样性和亲缘关系研究始于年，Choi等[17]将随机扩增多态性DNA（RAPD）标记技术用于评价地*愈伤组织再生植株的多样性；Hatano等[18]则将其用于诊断茎尖繁殖的地*品种和F1杂种。随后，陈京荔等[19]、周延清等[20]、吴志刚等[21]、王艳等[22]、石海霞等[23-24]相继利用RAPD、简单重复序列区间（ISSR）、相关序列扩增多态性（SRAP）、目标起始密码子多态性（SCoT）标记技术分析了地*种内变异及亲缘关系。然而，上述分子标记由于自身的局限性，不能有效区分杂合体，而且根据其他植物分子标记位点的通用引物来进行地*种质资源的研究，特异性较差。为此，郭冠瑛[25]基于地*转录组数据，开发出上千个表达序列标签-微卫星（EST-SSR）位点以提高地*资源鉴定的精确度和分辨率。地*种内遗传多样性的研究表明，野生地*的遗传关系与地理位置紧密相关，同一地域的野生地*亲缘关系较近[23]。营养繁殖、人工栽培虽在一定程度上降低了地*品质退化速度，但也导致主栽品种遗传背景单一，居群内部遗传多样性不足、居群间基因交流有限、遗传分化显著等不良后果[22,24,26]。因此，在地*良种培育中，应注重引入比栽培品种遗传差异更丰富的野生资源优异基因[22-23]，同时应注意同一品种的繁殖代数，避免因遗传突变而引发品质退化。
2地*的分子鉴定
地*是高度杂合体，为保证品质稳定，生产上采用块根繁殖，但品种间的表型差异并不明显，药农在选种、育种中种源混杂难以避免，“同名异物”和“同物异名”的现象比较严重，DNA分子标记技术为地*种质鉴定提供了科学合理、快速简便的方法。目前用于地*分子鉴定的标记主要有2类：一类是基于聚合酶链式反应（PCR）的分子标记。如Kim等[3]利用RAPD技术筛选出用于鉴别中、韩地*的特殊引物。周鹏[27]以RAPD技术为基础，成功将S引物转化为序列特征扩增区（SCAR）标记，获得1条稳定扩增的特异片段用于地*的快速鉴定。周延清等[28]筛选出1对用于鉴别怀区10个品种地*的ISSR引物。谷凤平[29]进行了地*SRAP反应条件的优化并构建了怀地*23个品种的DNA指纹图谱，筛选出适合22个怀地*品种SRAP分析的引物12对。最近，杨珂等[30]通过优化SCoT-PCR反应体系，获得14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物，并选择其中5条引物构建了地*和裂叶地*2个种共30份种质的SCoT指纹图谱，能将7个地*常用栽培品种（北京2号、金状元、金九区、红薯王和抗育、北京3号、温85-5、金九）进行有效区分。另一类用于地*分子鉴定的分子标记是DNA条形码，主要有核ITS/ITS2及叶绿体trnS-trnG、psbA-trnH、trnL-F和trnM-V等。但由于地*属存在种间渐渗杂交、物种间DNA变异界限模糊，以及该属植物在经历快速成种过程中种间遗传变异不够显著等问题[10,16]，导致单独使用ITS标记或少量叶绿体DNA条形码片段组合也难以进行种质鉴定[31]。为此，多位学者基于核基因和叶绿体基因的遗传模式差异，利用叶绿体DNA条形码片段＋核基因ITS片段组合探讨了DNA条形码在地*属的适用性，认为trnS-trnG＋ITS[31]、psbA-trnH＋ITS[13]、trnL-F＋ITS和trnM-V＋ITS[14]等可作为地*属内中药材地*及其与同属近缘种鉴定的条形码序列，而rbcL、matK则不适合[32]。
3地*功能基因研究
3.1活性成分生物合成相关基因
地*环烯醚萜（iridoidsglycosides）类化合物以环戊烷环烯醚萜为主，在植物体内与糖基形成不同的环烯醚萜苷，是地*的主要活性成分之一，至今已分离鉴定出30余种[33]，其中梓醇作为地*质量评价指标之一。地*环烯醚萜苷的生物合成途径包括经2-甲基赤藓糖-4-磷酸途径（MEP）形成前体，由萜类合酶催化形成环烯醚萜骨架，而后在修饰酶的作用下形成不同的萜类化合物3个阶段（图1）[34]。目前，环烯醚萜苷类生物合成研究主要集中于萜类合成的上游部分，基因序列多由转录组数据获得，大多数基因并没有全长序列的报道[35-36]。Sun等[36]基于转录组测序找到所有萜类骨架生物合成相关基因和4个仅在产生裂环烯醚萜类植物中克隆、鉴定的环烯醚萜途径基因。吉雪琪[37]从转录组中筛选出地*环烯醚萜生物合成上游途径中较重要的10个基因家族共个基因，并在地*2个生长期和16个组织中进行基因表达。分析表明，甲羟戊酸（MVA）途径的乙酰辅酶A酰基转移酶（AACT）和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因的表达与环烯醚萜的合成无明显对应关系；MEP途径的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（DXR）和1-羟基2-甲基-E-丁烯基4-焦磷酸还原酶（HDR）基因主要在叶片中表达，其中DXS基因属于DXSII型和DXSIII型，DXR3基因的表达量与叶片中梓醇、总环烯醚萜苷含量显著正相关；认为牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS）可能为异源二聚体，是调控地*中梓醇合成的关键酶。朱畇昊等[35]从转录组数据中找到编码萜类骨架合成的unigenes81条，参与细胞色素P酶（CYP）介导的地*环烯醚萜合成后修饰的unigenes条，以及糖基转移酶相关的unigenes条。上述基因中，RgDXR、RgGGPPS1、RgGGPPS2等基因序列已被克隆。RgDXR基因cDNA全长为bp，编码个氨基酸，含4个典型功能结构域，即1个NAD（P）结合结构域、1个DXR蛋白N端结构和2个DXR蛋白C端结构域[38-39]。RgGGPPS1基因cDNA全长bp，编码个氨基酸，RgGGPPS2基因cDNA全长bp，编码个氨基酸，两者均含2个富含天冬氨酸的保守基序。其中GGPPS2与梓醇的合成有关，GGPPS1、G10H与总环烯醚萜苷的合成有关[40]。
苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷是地*质量评价的另一指标性成分，其生物合成起始于苯丙氨酸和酪氨酸，酪氨酸通过酪胺、多巴胺合成毛蕊花糖苷的羟基酪醇部分，苯丙氨酸通过肉桂酸途径合成咖啡酰基团，其中转苯丙氨酸酶（PAL）基因和酪氨酸脱羧酶基因（TyDC）是毛蕊花糖苷合成的关键酶基因[41-42]。王丰青等[43]依据地*转录组数据克隆出地*RgTyDCcDNA序列，并进行基因表达的时空特异性检测。索艳飞[44]通过转录组测序鉴定出PAL、C4H、C3H、TyDC、DODC、CuHO、ALDH与毛蕊花糖苷合成相关的酶基因cDNA片段。王向楠[45]基于地*块根的转录组数据，并结合文献梳理了毛蕊花糖苷生物合成途径（图2），确定了19个候选毛蕊花糖苷生物合成酶对应的基因，并对叶绿体的天冬氨酸转氨酶（ASP5）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、肉桂酸羟化酶（C4H）、香豆酸3-羟化酶（C3′H）、伯胺氧化酶（AO）、莽草酸-肉桂酰转移酶（HCT）、预苯酸脱水酶（ADT）、线粒体的天冬氨酸转氨酶（GOT2）8个酶基因进行序列分析和空间特异性表达，研究表明上述酶基因与毛蕊花糖苷生物合成呈正相关。
3.2地*增产相关基因
地*增产主要指块根的膨大程度，根系的膨大受生理（激素）、环境因素等多种因素的综合影响，但最终均通过遗传物质影响着地*块根的膨大，包括与细胞分裂、伸长和细胞壁生长相关基因的调控。
3.2.1细胞分裂、伸长相关调控基因细胞分裂、伸长与植物形态和器官大小密切相关，并受乙烯、细胞分裂素、赤霉素、油菜素内酯和生长素等调控。通过地*离体培养、栽培地*和野生地*块根发育比较，证实地*块根的形成与发育受多种内源激素的协同作用，尤其是拉线期和块根膨大前期最为关键，期间生长素（IAA）、细胞分裂素（CK）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ETH）的合成和响应基因上调与赤霉素（GA）合成基因的下调能促进块根的发育与膨大[46-48]。侯维海[49]分别克隆了ABA、GA合成关键酶基因ABA8′oxs、GA20-oxs及其代谢关键酶基因NCED、GA2-oxs。经表达分析，在块根发育中NCED的上调表达能促进ABA合成，ABA8′oxs则相反，而GA的变化主要是GA2-oxs表达上调后诱导降解的结果，与GA20-oxs的相关性不强。植物激素信号传导包括信号识别、相关基因表达及作出生理响应，如Aux/IAA和ARF是生长素信号传导必需的2类转录因子家族，地*RgIAA1cDNA全长bp，编码个氨基酸，在地*幼叶表达量最高[50]。而ARGOS基因在生长素诱导下，作用于转录因子ANT基因的上游，并通过ANT基因影响细胞的分裂和伸长[51]。周延清等[52-53]根据5种已知植物ARGOS基因的保守序列克隆了液泡质子泵焦磷酸水解酶基因RgVP、3-酮酯酰CoA-硫解酶基因RghKAT和RglKAT，并对部分基因进行荧光定量分析和原核表达，获得诱导表达蛋白产物，但该研究未进行转化实验，缺少对其过量表达时的功能分析。
3.2.2细胞壁生长相关基因植物细胞壁的生长，受扩展蛋白、纤维素合酶、果胶酯酶、木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶等调控。其中扩展蛋白是一种能诱导细胞壁松弛的特异性蛋白，在酸性条件下，能通过半纤维素降解，打断半纤维素与纤维素微纤丝之间氢键等快速缓冲细胞壁的承重网络，使细胞壁组分松弛、恢复伸展活性[54]。臧亚超等[55]从地*块根EST文库中筛选到9个扩展蛋白基因，其中RgExpA1最有可能参与地*块根木质部的形成发育，该基因含3个外显子和2个内含子，基因全长bp，编码个氨基酸，N端富含8个半胱氨酸、C端富含5个色氨酸保守结构域和中间1个组氨酸功能域。而RgExpA10在块根发育的早期，即在膨大期作用较大，该基因cDNA全长bp，编码个氨基酸，包含具有调控转录功能的DPBB_1和与细胞膨大相关的Pollen_allerg_1结构域。植物细胞的伸长方向由细胞壁主要组成成分纤维素微纤丝的纤丝角度决定，参与纤维素微纤丝生物合成的许多酶由纤维素合酶CesA基因家族编码，即纤维素合酶CESA蛋白。有证据表明，CESA4、CESA7和CESA8作用于初生和次生细胞壁的纤维素合成[56]。周延清等[57]克隆了怀地*纤维素合酶基因RghBNG，cDNA全长bp，编码93个氨基酸，该基因与根瘤菌纤维素合成酶基因同源性较高，而与其他植物纤维素合酶基因不同源，可能是地*块根与根际根瘤菌共生过程中发生DNA片段转移的结果。但有关地*果胶酯酶、木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶等基因的研究迄今未见报道。
3.2.3基于转录组学的块根发育机制研究除上述传统的研究方法外，转录组学技术也被应用于地*块根的发育机制研究。Li等[58]通过比较地*苗期须根和膨大期块根的转录组数据，发现两者的染色质修饰和DNA复制相关基因的表达存在显著差异，这些差异的产生与其相对应的转录子含量有关，如DNA甲基转移酶/去甲基化酶基因在块根不同发育过程中的差异表达与其转录子含量的变量呈正相关[59]，连作地*块根发育中S-连作腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶、乙酰基转移酶、与组蛋白赖氨酸甲基化相关的甲基化酶等的转录子含量也发生变化[60]。此外，李明杰[61]还结合差异基因表达谱（DGE）、iTRAQ蛋白差异表达谱筛选出块根发育关键基因及其蛋白，利用miRNA差异表达谱和降解组技术鉴定了调控块根发育的关键miRNA及其靶基因，初步阐明miRNA在地*块根发育中的决定机制。
3.3地*抗逆相关基因
逆境胁迫影响着植物的生长发育，地*逆境胁迫功能基因的研究较少，如RghBNG基因是一个多功能蛋白基因，除与地*器官形成、发育有关外，对非生物胁迫胁迫、生长调节剂等也有应答反应，地*RghBNG基因过表达植株的获得有助于进一步阐明该基因的功能[62-63]。地*RgIAA1对不同的逆境胁迫响应水平不一，在连作时表达量升高，但受盐和渍水胁迫时表达量下降。PR基因在植物受病源微生物侵袭或逆境胁迫时被诱导表达，地*RgPR-10基因主要在根茎中表达，但其确切功能还有待确定[64]。为鉴定地*根部响应涝胁迫关键基因，王翠英等[65]利用转录组测序和数字表达谱技术，获得个涝胁迫地*块根差异表达基因，其中约35%的基因参与乙醇发酵，乙烯合成，钙信号途径，WRKY、GRAS和NAC等胁迫相关的转录因子基因上调表达，而与生长调控相关的转录子基因，如BHLH、MYC、BYB、MADS-box等约65%的基因则下调表达。
3.4地*连作障碍相关基因
研究表明，地*根系分泌的自*化感物质的伤害作用及根际微生物群落的失衡（如酚酸类物质能选择性地促进或抑制某些特异微生物的生长，引起的土壤原有微生物群落的失衡）是引起地*发生连作障碍的主要原因[66-68]。为揭示连作地*面对自*物质的直接伤害和微生物失衡所致的间接伤害时的分子响应机制，张重义等[69]、范华敏等[70]利用SSH技术构建了头茬和重茬地*的cDNA消减文库，鉴定了部分响应连作障碍的特异表达基因，如钙依赖蛋白激酶基因、SAM合成酶基因、ACC氧化酶基因、甲基转移酶基因和钙蛋白酶基因等与钙信号传导、乙烯合成及染色质修饰相关的特异表达基因。Yang等[60,71-72]利用地*转录组及头茬与重茬地*根部、叶片基因数字差异表达谱初步筛选出响应地*连作障碍的差异表达基因，如检测到重茬地*中钙信号体系相关蛋白基因有2个背向细胞质的钙离子通道下调表达，10个朝向细胞质的钙离子通道上调表达[73]。至此，地*连作障碍的感知、传导和响应过程被初步明确，即化感物质（如有机酸、醛类芳香酸、香豆素、醌类、生物碱和萜类等植物次生代谢产物，其中酚类和萜类化合物是高等植物的主要化感物质）被钙信号感知和传递后诱导乙烯合成，经组蛋白修饰等机制抑制地*生命过程中关键调控基因的正常表达，引起连作障碍（图3）。这一推测也得到内质网型Ca2+-ATPase基因的克隆与表达[74]、地*钙信号体系相关基因的鉴定及其在连作条件下响应特征分析[75]和连作地*根细胞基因组的胞嘧啶甲基化[76]等研究的进一步验证。
地*连作障碍在本质上是属于逆境胁迫现象之一，植物在抵御或防卫逆境胁迫时，除诱导蛋白编码基因表达外，也会诱导非蛋白编码基因的表达，如miRNAs就是其中的重要类群，它能通过引导目的基因mRNAs的降解和阻止翻译来调控靶基因的表达以达到对逆境的适应。近年的研究表明，重茬地*体内存在特异miRNAs参与连作障碍的分子调控，包括参与连作地*的转录调节、激素代谢、信号传导、逆境响应等。目前功能比较明确的地*miRNAs，主要有miR、miR、miR、miR、miR、miRZ21、miR、miR等家族调控信号传导相关基因的表达，miR、miR/miR等家族调控营养运输相关基因的表达，miR、miR、miR、miR、miR等家族调控细胞分裂分化相关基因的表达，miR、miR、miR、miR、miR-3b/novel_mir_2、miR等家族调控须根膨大相关基因的表达，miR、miR、miR等家族调控生殖器官发育相关基因的表达[77-81]。此外，地*类似非编码RNA，如mlncRNA可能也参与地*连作障碍的调控。刘驰[82]研究表明，重茬地*的叶中个mlncRNA基因表达显著上调，个mlncRNA基因下调表达，重茬地*的根中有个mlncRNA基因表达显著上调，个mlncRNA基因下调表达。时空表达研究表明，大部分的mlncRNAs表达模式与连作障碍的发病规律一致。
4展望
地*的系统学研究，分子鉴定和功能基因研究已经取得可喜的进展，利用分子标记不但实现了地*属植物的分子鉴定，而且也较全面地揭示了该属植物种群的遗传多样性和亲缘关系，利用转录组学研究初步揭示了地*连作障碍的分子机制和萜类物质合成代谢的关键酶基因的研究，另外还克隆、表达了部分与地*生长发育和抗逆相关的基因。但作为大宗药材之一，地*的分子生物学研究还不够全面、系统，有待进一步深化。笔者认为今后地*的分子生物学研究，第一要注重新型分子标记的开发。DNA分子标记是生物个体在DNA水平上遗传差异检测的有效手段，被广泛应用于遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传图谱构建、QTL定位及克隆、基因差异表达分析、基因定位及克隆、比较基因组学、系统进化研究、转基因植物鉴定及分子标记辅助育种等各个方面[83]。目前还只是随机分子标记和少数种类的目标分子标记在地*中得到应用，其他种类的目标分子标记、功能性分子标记和目的基因分子标记等新型地*分子标记还有待开发。第二要注重地*药用成分生物合成途径关键酶基因的解析及其调控机制研究，阐明地*药用成分生物合成途径，对研究其生物合成调控机制和定向调节代谢产物合成至关重要。目前仅有RgDXR等少量酶基因被克隆获得基因的全长序列，至于转录后或翻译水平调控研究更是少见报道。因此，要综合运用多种组学技术，从不同侧面系统揭示地*活性成分的遗传信息表达和调控机制，为将来利用分子生物技术、生物信息学技术等手段控制遗传信息来分析和合成药用成分打下基础。第三要注重地*连作障碍的分子机制研究。连作障碍对地*的生产造成重大影响，目前虽然取得了初步进展，明确了地*连作胁迫在转录组、蛋白组和miRNA组等水平上均受影响，初步了解了地*连作障碍的形成脉胳，但连作障碍的形成机制非常复杂，是复杂的外界环境因子和众多的内部响应基因综合作用体现，要用系统的思维、综合运用多种方法去揭示其背后的真实规律，从而为最终发现连作障碍形成的分子机制，培育出对化感物质不敏感的新品种打下坚实基础。
参考文献（略）来源：詹忠根.地*分子鉴定及功能基因研究进展[J].中草药,,50(22):-.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇