前言
熟地黄的根中含有许多具有重要医学特性和营养价值的化合物，本篇由鹿明生物合作客户河南师范大学生命科学学院团队发表的“熟地黄根部代谢产物积累和代谢网络揭示发育机理和品质”的文章，通过LC-MS非靶标代谢分析，揭示了中药地黄在生长过程中的代谢调控网络和作用机制，发现了新的候选标志物，可用于药材的质量控制。
中文标题：熟地黄根部代谢产物积累和代谢网络揭示发育机理和品质
材料：地黄根
主要运用生物技术：LC-MS非靶向代谢组学（由上海鹿明生物科技有限公司提供技术支持）
文章背景
地黄是中医学重要的多年生草本植物，其根部富含生物活性化合物，可用于发烧、神经疾病、糖尿病和高血压的治疗，也有增强肝功能、增强造血功能和免疫防御的功效。近年来多层组学整合研究方法已被应用到地黄研究中，可更好地了解块茎根的形成和发育，发掘生物活性成分相关基因和根部活性成分的生物合成途径。在本研究中通过非靶向LC-MS代谢组学方法，运用多变量和单变量分析阐明地黄根中代谢产物的积累和代谢网络，比较地黄根在三个发育阶段的代谢谱。为中药地黄的质量控制和治疗机理奠定研究基础。
研究思路
研究方法
1.实验材料培育及分组
采集三个发育阶段的地黄根，即延伸阶段（E），扩展阶段（T）和成熟阶段（M），这些样品被标记为伸长根（ER），膨胀根（TR）和成熟根（MR）。
2.检测方法：LC-MS非靶标代谢组学技术
研究结果
1.基于LC-MS非靶向代谢组定性结果的多元统计分析
对于ER/TR，ER/MR和TR/MR三个比较组，作者分别使用PCA，PLS-DA和OPLS-DA绘制得分图，并构建了OPLSDA模型的验证图（图1），模型参数汇总在表1中。
图1三个比较组的PCA，PLS-DA，OPLS-
（a）TR/ER比较组的PLS-DA；（b）TR/ER比较组的OPLS-DA；（c）TR/ER比较组的OPLS-DA验证图；（d）MR/TR比较组的PLS-DA；（e）MR/TR比较组的OPLS-DA；（f）MR/TR比较组的OPLS-DA验证图；（g）ER/MR比较组的PLS-DA；（h）ER/MR比较组的OPLS-DA；（i）ER/MR比较组的OPLS-DA验证图；（j）TR/ER比较组；MR/TR比较组和ER/MR比较组的PCA得分图；
表1
模型评估参数
2.差异代谢物的筛选和鉴别
按照VIP1和倍数变化（FC）1的标准筛选两个比较组之间的差异代谢物，共筛选出种差异代谢物，有种可定性，包括ER/MR的种，ER/TR的种和TR/MR的85种。其中种为非重复差异代谢物，三个比较组共有常见代谢产物有种。
3.代谢通路富集
将种差异代谢物映射到KEGG通路，共富集到条KEGG途径（表2）。作者研究了重要性排序前10的KEGG富集通路。
表2
已鉴定代谢物的功能分析
（1）ER/TR对照组：前10条KEGG途径包括植物次生代谢产物的生物合成、蛋白质的消化和吸收、氨基酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、ABC转运蛋白、2-氧代羧酸代谢、氨酰基-tRNA生物合成、脂肪酸生物合成、苯丙氨酸和酪氨酸和色氨酸生物合成以及源自萜类和聚酮化合物的生物碱:生物合成（图2）；
（2）TR/MR对照组：前10条KEGG途径包括ABC转运蛋白、萜类和聚酮化合物衍生的生物碱的生物合成、胆碱能突触、味觉传导、2-氧代羧酸代谢、莽草酸途径衍生的生物碱的生物合成、碳水化合物的消化吸收、矿物质吸收、β-丙氨酸代谢和苯丙氨酸以及酪氨酸和色氨酸的生物合成，其中前6条KEGG通路差异显著（p0.05）。
（3）ER/MR比较组：前10条KEGG途径包括苯丙氨酸代谢、蛋白质消化和吸收、植物次生代谢产物的生物合成、甲苯降解、苯丙氨酸和酪氨酸和色氨酸的生物合成、代谢途径、脂肪酸的生物合成、氨基苯甲酸酯的降解、氨基酰基-tRNA的生物合成和苯丙烷类的生物合成，并且差异显著（p0.01）（图2）。
图2TR/ER，TR/MR，MR/ER比较组的网
网络图包括方框（前十个路径）、点（酶）、圆角矩形（化合物）和线
4.代谢网络分析
为揭示KEGG途径与相关酶和化合物相互作用机理，进行代谢网络构建。
（1）首先对于TR/ER比较组：该网络包含38种酶，10条途径和31种化合物。一种化合物可能与1-8个途径或酶发生相互作用；一种途径可能与2-17种化合物相互作用；一种酶可能与1-5种化合物相互作用。化合物的FC变化很大。在ABC转运蛋白和植物次生代谢产物的生物合成中，大多数化合物的含量增加，但在β-半乳糖苷酶的作用下乳糖和麦芽三糖的含量下降。在脂肪酰基-ACP硫酯酶A的作用下，油酸、硬脂酸和辛酸的含量均降低。在脂肪酸的生物合成中，癸酸、辛酸、月桂酸和油酸的含量均降低。棕榈酰蛋白硫酯酶和脂肪酰基ACP硫酯酶A的作用，在其余8条KEGG途径中，代谢物表达水平普遍增加。此外代谢物水平变化与网络分析的变化相同。例如在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径中，在酪氨酸脱羧酶的作用下，L-色氨酸和吲哚的水平增加，而苯乙酸、苯甲酸、2-羟基苯甲酸和D-甲硫氨酸的水平升高。在苯丙氨酸代谢途径中，在4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶的作用下，β-内毒素的增加（图2）。
（2）其次对于MR/TR比较组：该网络包含8种酶、10条途径和9种化合物。一种化合物可能与14种途径或0–3种酶相互作用。一种途径可能与1-2种化合物相互作用；一种酶可能与一种化合物相互作用；化合物的FC变化很小。在代谢途径中，大多数化合物的含量增加，但2-脱氧鸟苷、9-羟基芴和质体喹啉的含量在5,6-二氢-5-甲基尿嘧啶5-核苷酸酶、细胞分裂素脱氢酶的作用下均降低。和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶，在植物次生代谢产物的生物合成中，大多数化合物的含量增加，但在棕榈酰蛋白硫代酯酶的作用下，油酸、硬脂酸和辛酸的含量下降。在脂肪酸生物合成中，烟酰胺、油酸、硬脂酸和辛酸的水平降低。在其余的七个途径中，大多数化合物的水平在酪氨酸脱羧酶和色氨酸合酶的作用下均升高（图1和2）。此外前10条KEGG途径中代谢物水平的变化与网络分析所揭示的变化相同。
（3）第三对于ER/MR比较组：该网络包含33种酶、10条途径和33种化合物。一种化合物可能与1-4个途径或酶发生相互作用。一种途径可能与3-23种化合物相互作用；一种酶可以与1-2种化合物相互作用；化合物的FC差异很大。在ABC转运蛋白和植物次生代谢产物的生物合成途径中，在肉桂醇脱氢酶，棉子糖合酶和蔗糖合酶的作用下，蔗糖和胆碱的水平增加。在胆碱能突触中，胆碱水平升高。在β-丙氨酸代谢中，醛脱氢酶（NAD+）、聚胺氧化酶（丙烷-1,3-二胺形成）和4-氨基丁醛的含量降低。在源自莽草酸途径的生物碱的生物合成中龙胆苦素的水平减少。在味觉转导和碳水化合物消化吸收的途径中，蔗糖水平升高。在2-氧代羧酸代谢的途径，源自莽草酸酯途径的生物碱的生物合成，矿物质吸收和苯丙氨酸以及酪氨酸和色氨酸的生物合成中，L-苯丙氨酸水平降低（图2）。
这些结果表明，地黄根存在复杂的分子网络和不同代谢物-相关酶相互作用机理。
5.常见差异代谢物的热图
为了表达差异代谢物之间的聚类关系，使用种常见差异代谢物的峰面积构建热图，其中48个代表性差异代谢物热图(见图3)，作者发现：
（1）一些具有相同变化趋势代谢物的常见途径。例如，“组3”是一类代谢物，从ER（低）到MR（中）到TR（高）呈上升趋势，主要包括生物碱、吲哚、脱落酸、脂肪酸、苯甲酸等，所涉及的代谢途径有甲苯降解、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、植物次生代谢产物的生物合成、氨基苯甲酸酯降解等；“组4”是一类代谢产物，从ER（低）到MR（中）到TR（高）呈上升趋势，主要包括扁豆酚、烟酰胺等。
（2）一些代谢物在根部发育过程中显示含量增加，可能具有医学和营养价值。例如表达上调L-色氨酸和烟酰胺。
（3）某些特定代谢物可能更适用于地黄根的质量控制。例如肉桂酸、1-十六烷基溶血磷脂酸和9-羟基-7-megastigmen-3-葡萄糖苷。热图显示了差异代谢物和样品之间相似的变化关系。
图348种鉴别出的代谢物的热图
相关讨论
在本研究中，基于非靶向LC-MS的代谢组学方法，多变量和单变量分析被用于鉴定差异代谢物。在三个比较组中的任意两个之间（例如ER/TR，TR/MR和ER/MR）鉴定出种非重复的差异代谢物（表2），其中个是三个比较组中的常见差异代谢物。据文献报道从地黄根中已发现了多种化合物。在本研究中，通过基于LC-MS的非靶向代谢组学方法鉴定了更多差异代谢物，显示了其高效性以及地黄根代谢物的多样性和丰富性。而且众多差异代谢产物表明，不同发育阶段的地黄根的质量不同。
由于梓醇和毛蕊花糖苷被认为是地黄根的两个重要成分，因此通常在收获时使用它们来评估地黄根的质量。此外还发现地黄根中梓醇含量在其根系发育过程中呈上升趋势，在其成熟阶段的成熟块茎根中含量最高，与传统收获期相吻合。在这个时期毛蕊花糖苷含量也最高，与先前文献报道不一致。这表明在不同品种地黄种，毛蕊花糖苷含量变化趋势可能有所不同。此外作者发现，许多差异代谢物的含量在地黄生长过程中呈上升趋势，在其成熟阶段的成熟块根中含量最高（图2），并发现了一些特定的差异代谢物，例如肉桂酸、1-十六烷基溶血磷脂酸，9-羟基-7megastigmen-3-葡萄糖苷，与梓醇和毛蕊花糖苷相比，更适合用于熟地黄根的质量控制。
从网络分析图可以看出，三组根系之间比较，差异代谢物数量、含量升高或降低，及其相关酶数量不同（图2）。代谢物和酶的总数排名如下：ER/TRER/MRTR/MR比较组。该排名还适用于代谢物与KEGG途径和酶相互作用的复杂程度。作者发现：（1）前10条富集代谢途径的数量、变化水平以及差异代谢物的聚集经历了相似的变化模式；（2）差异代谢产物与酶的相互作用是比较复杂的；（3）前10条富集代谢通路变化水平与差异代谢物水平的变化趋势相吻合。综上所述，这些积累变化模式和相互作用机制调控着地黄的生长。
实验结论
作者使用非靶向LC-MS代谢组学分析了地黄根在三个不同发育阶段的代谢谱。多变量分析显示种代谢物在其不同阶段的积累不同，表明变化趋势不同。具有相同趋势的代谢物具有共同的代谢途径，在生长过程中含量增加的代谢物具有医学和营养价值，某些成熟根系的特异性代谢物可作为质量控制的候选标记物。种代谢物被定位到种KEGG途径中，包括62种酶，在其发育过程中表现出增加和减少趋势。在网络分析中，一些代谢物与某些酶相互作用复杂，并且从个KEGG途径中富集了前10个途径。这些发现扩展了鉴定化合物的数量，并揭示了地黄根系生长和质量与不同代谢产物的积累有关。该工作将为更好地了解地黄化学成分、质量和发展机理奠定基础。
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中药质量控制一直是药材重要的环节之一，本文作者从代谢组学的角度，研究了不同生长时期地黄根的代谢变化特征，不仅发现了重要代谢物与代谢途径，还得到了新的质控潜在候选标志物，其研究思路和结论可为该领域的研究提供指导。
文末看点
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部分文献参考
1.Zhou,L.etal.Integratingtargetedgly