Khorana等在最早提出了核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”年Mullis等在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，从此核酸体外合成的方法PCR（聚合酶链式反应）开始广泛应用。
引物（Primer）通常是人工合成的一段具有特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，长度一般为18~28nt。其功能主要是与靶序列一段的DNA或RNA模板链互补，作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点。
引物类型多样，如广泛应用于PCR反应的与靶序列特异性结合的特异性引物；应用于多态性分析的随机的核苷酸序列（一般小于20nt）比如RAPD引物、SSR引物等；而对寡核苷酸序列进行各种化学修饰或荧光标记后的修饰引物/探针的应用更为广泛，后续我们也将以“修饰引物/探针”为专题进行深入介绍与分享。
修饰引物/探针
修饰引物/探针是在普通引物的序列上添加了化学基团或改变了碱基与磷酸二酯键，以达到靶标检测、防止降解、增加稳定性等等目的，修饰类型有余种，按照位置可以分为引物的3端修饰、5端修饰和中间修饰，通常将添加荧光标记的修饰引物称为探针。
应用：
1、分子生物学基础研究：包含检测、互作、功能等方向的qPCR、Fish、EMSA和RNA干扰等实验。
2、分子诊断：与我们日常生活相关的核酸检测是荧光探针的主要应用领域，除此之外还有遗传学诊断、伴随诊断、病原微生物检测、肿瘤早筛等领域。
3、核酸药开发：ASO、siRNA和miRNA通过碱基互补配对原则靶向mRNA或pre-mRNA，通过基因沉默抑制靶蛋白的表达从而实现治疗疾病的目的。
常用部分修饰类型：
生物素（Biotin）
生物素修饰的寡核苷酸能紧紧地结合在链霉亲和素蛋白上，链霉亲和素蛋白可以标记上荧光染料和酶或作为附着的中间结合物附着在固体物生物表面，不同的分子生物学和纯化方法都包含生物素修饰。生物素修饰可以利用C6或是TEG间臂被添加在寡核苷酸的5或末端，生物素TEG需要纯化，中间的生物素修饰可以通过dT碱基加入，这种形式需要更多的纯化步骤。引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
地高辛（Digoxigenin）
地高辛是一种从毛地黄植物分离出来的类固醇物质，因为毛地黄植物的花和叶子是这种物质唯一自然来源，所以抗地高辛抗体不会结合到其他生物物质。
地高辛经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置。杂交的地高辛探针可以由抗地高辛抗体来检测，这个抗体一般会与碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素或胶体金偶连。或没有偶连的抗地高辛抗体但偶连的抗体。地高辛标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southernblotting）、DNA-RNA杂交（Northernblotting）、斑点杂交（Dotblotting）、克隆杂交、原位杂交及酶联免疫分析（ELISA）。
磷酸化（Phosphorylation）
5磷酸化作用是通过B-氰乙基化学反应添加到引物5端的糖环上，而不是最后一个碱基上；3磷酸盐被连接到固体支持介质上，所以在合成的第一个循环，碱基就与它偶联。3磷酸化修饰具有阻止聚合酶延伸的功能。5磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。磷酸化可抗外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。
硫代（Phosphorothioate）
随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行硫代修饰，通常可以选择5和3各3个碱基进行硫代修饰。硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。
内部氨基修饰
主要用C6-dTaminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接(如碱性磷酸酶)。
5氨基修饰
主要分为5C6氨基修饰和5C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片(DNAMicroarray)和多重标记诊断系统，目前主要用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物。
3氨基修饰
主要为C6氨基修饰，它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3修饰可以抑制3外切酶酶解，从而可用于反义实验。
荧光、淬灭基团：
修饰引物/探针与普通引物对比：
1、价格更高，合成修饰引物需要的修饰原料稳定性较差，合成偶联时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要HPLC纯化，纯化过程损失大，而且修饰引物使用的原料价格高于一般引物原料很多倍，所以修饰引物的价格更高。
2、周期更长，合成修饰引物一般需要在合成过程中或者合成结束添加修饰基团，相较普通引物合成就会花费更多的时间，且在后续纯化过程中，花费的时间比普通OPC纯化需要更长的时间，所以交付周期会相对更长。
3、纯化特殊，普通引物一般使用OPC纯化，即通过反相层析柱对DNA片段进行纯化，可将合成失败的不完整DNA片段去除，适用于60mer以下引物的纯化，得到的DNA纯度通常在85%~95%；但修饰引物/探针需要使用HPLC纯化，即通过高效液相色谱原理，依据DNA的疏水性对DNA片段进行分离纯化，可以有效的去除失败序列或未结合的标记物，得到的产物纯度大于95%。
4、存储严格，干粉状态引物非常稳定，-20℃下可保存2-3年，甚至更长。溶解后的引物-20℃下避免反复冻融，可以保存至少一年以上。荧光探针必须避光保存，建议用RNase-free的TEbuffer(pH8.0)溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。
